TransEasy電轉液

外源基因導入細胞方法有多種,包含物理、化學、生物等不同方法。物理方法最常見的是電轉方法,對于各種細胞外源基因轉入的效率都很高,包含各種原代細胞。化學方法常用的是lipofectamin等轉染試劑,轉原代細胞能力差很多,價格高;生物方法則常用慢病毒、仙臺病毒等,可以轉原代細胞,但是成本又很高,前期病毒的包裝與鑒定等耗時耗力。

賽貝生物(Cellapy?)推出TransEasy電轉液,適用于Lonza2B、Lonza4D電轉儀,可通用。


  • 產品介紹
  • 產品說明書

貨號:CA3012040

規格:4 mL

儲存條件:

基礎液-20℃,添加劑-80 ~ -20℃,接種液-20℃;混勻后2~8℃,1個月內使用完畢。

產品簡介:

質粒電轉是利用瞬間高壓造成細胞膜的不穩定,形成電穿孔,將核苷酸、DNA與RNA、蛋白、糖類、染料及病毒顆粒等導入原核和真核細胞內的實驗技術,可以應用到轉染、轉化、電融合與插入等。

賽貝生物(Cellapy)通過實驗探索,對比各種不同條件后開發并推出了一種穩定、高效的電轉試劑:Trans Easy。該電轉試劑可大幅提高電轉效率和電轉后細胞的存活率,是一種安全、快速、經濟的選擇。

本說明書將以體細胞質粒電轉重編程為誘導多能干細胞實驗和特定基因敲除細胞系構建實驗為例介紹該產品的用法。

產品內容:

組份代碼

名稱

規格

數量

CA3012040-1

Trans Easy電轉試劑基礎液

4 mL

1瓶

CA3012040-2

Trans Easy電轉試劑添加劑

80 μL

1支

CA3012040-3

Trans Easy電轉試劑細胞接種液

200 μL

1支

試劑準備:

將基礎液與添加劑在(2~8)℃完全溶解,把添加劑加入基礎液中,并顛倒混勻,組成電轉工作液。若短期內使用次數較少,可根據使用量將基礎液與添加劑按50:1的比例混勻,剩余量分裝后置于-80 ~ -20℃保存。電轉試劑細胞接種液在電轉后使用,推薦用量為1:2000,所有試劑避免反復凍融。

所需材料:

Trans Easy電轉試劑盒(Cellapy:Cat.CA3012040)

電轉儀(Lonza,   4D-Nucleofector,Amaxa,   Nucleofector)

電轉所需質粒

用于電轉的細胞

其他常規培養液、培養板等

使用方式:

(一)人多能干細胞特定基因敲除細胞系的構建:

1.   提前一天使用適量基質膠包被六孔板,37℃恒溫二氧化碳細胞培養箱過夜備用;

2.   實驗前吸棄基質膠,加入2 mL多能干細胞培養基(可用賽貝公司PSCeasy: Cat.CA1001500 或PGM1:Cat.CA1007500)到六孔板中,按1:2000加入Trans Easy電轉試劑細胞接種液1 μL,再放入37℃培養箱預平衡10 min;

3.   取100 μL電轉工作液加入到無菌EP管,再加入電轉所需質粒的量(推薦量為5 μg),質粒體積不超過10 μL,混勻后待用;

4.   培養人胚胎干細胞或人誘導多能干細胞至匯合度達到90%,消化傳代并計數,一次電轉所需細胞數為8 × 105

5.   取足夠電轉的細胞懸液到15 mL離心管,800 rpm 離心3 min;

6.   以Lonza 4D-Nucleofector為例,打開儀器并設置適當程序待用;

7.   盡可能多地吸棄上清,用(3)中混勻的電轉液100 μL 重懸細胞沉淀,動作迅速且盡可能不產生氣泡;

8.   迅速將上步中混合的細胞懸液轉移到儀器配套的電轉杯中,盡量不要產生氣泡;

9.   迅速將電轉杯放入電轉儀并點擊開始;

10. 電轉完成后迅速取出電轉杯,將細胞接種到步驟(2)中預先準備的培養板中;

11. 搖勻后37℃培養,第二天換為常規培養基;

12. 后續包括藥物篩選、挑克隆鑒定等。

(二)人皮膚成纖維細胞質粒重編程為人誘導多能干細胞:

1.   提前一天使用適量基質膠包被10 cm培養皿,37℃恒溫二氧化碳細胞培養箱過夜備用;

2.   實驗前吸棄基質膠,加入10 mL皮膚成纖維培養基到10 cm培養皿中,按1:2000加入Trans Easy電轉試劑細胞接種液5 μL,再放入37℃培養箱預平衡10 min;

3.   取100 μL電轉工作液加入到無菌EP管,再加入電轉所需質粒的量(推薦量為5 μg),質粒體積不超過10 μL,混勻后待用;

4.   培養皮膚成纖維細胞至匯合度達到80%,消化傳代并計數,一次電轉所需細胞數為1 × 105

5.   取足夠電轉的細胞懸液到15 mL離心管,800 rpm離心3 min;

6.   以Lonza 4D-Nucleofector 為例,打開儀器并設置適當程序待用;

7.   盡可能多地吸棄上清,用(3)中混勻的電轉液100 μL重懸細胞沉淀,動作要快且盡可能不產生氣泡;

8.   迅速將上步中混合的細胞懸液轉移到儀器配套的電轉杯中,盡量不要產生氣泡;

9.   迅速將電轉杯放入電轉儀并點擊開始;

10. 電轉完成后迅速取出電轉杯,將細胞接種到步驟(2)中預先準備的培養皿中;

11. 搖勻后37℃培養,第二天換為常規培養基;

12. 后續包括細胞形變、克隆形成、挑克隆等。

注意事項:

1.   將細胞懸液加入電轉杯時盡量不能有氣泡,氣泡的存在會影響電轉的成功率;

2.   所使用的質粒濃度不宜過低,不可使細胞沉淀+質粒體積+電轉試劑的總體積高于電轉杯的工作容量;

3.   電轉試劑與細胞混合后,要迅速進入電轉狀態,且電轉后的細胞要快速加入到提前準備好的培養皿中與培養基混合,減少細胞與電轉試劑的接觸時間。


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